Антиоксидантная активность и цитотоксичность экстракта Тунбергии лавроволистной

J. Food Ag-Ind.2008 г., 1(02), 116-128 Азиатский журнал

Пищевая и агропромышленность ISSN 1906-3040 Доступно онлайн по адресуwww.ajofai.info

научная статья

Антиоксидантная активность и цитотоксичность Rang Chuet (экстракта Тунбергии лавроволистной)

Ратчадапорн Унсивилаи1, Марио Г. Ферруцци2и Сувайд Нингсанонд1 1Школа пищевых технологий, Технологический университет Суранари, Юниверсити-авеню, 111, Муанг, Накхонратчасима, Таиланд, 30000 2Факультет пищевых наук, Университет Пердью, 745 Сельскохозяйственный торговый центр, Уэст-Лафайет, IN 47907, США

Автор, которому следует направлять корреспонденцию, электронная почта: Документ, первоначально представленный на Food Innovation Asia 2007.


Тунбергия лавроволистная или Rang Chuet (RC) широко описан в тайской традиционной медицине для защиты от пищевых и экологических токсикантов с небольшим обоснованием. Чтобы лучше раскрыть потенциал RC как лекарственного растения, экстракты готовили путем инфузии с водой, этанолом и ацетоном.

Антиоксидантную активность и общее содержание фенолов в экстрактах RC оценивали с использованием удаления свободных радикалов, анализа антиоксидантной способности сокращать железо (FRAP) и метода Фолина-Чокальтеу. Было обнаружено, что водная экстракция фенольных соединений была наиболее эффективной (2433,9 мг ЭГЭ/100 г) по сравнению с экстракцией этанолом и ацетоном, которые имели содержание фенолов 565 и 142,1 мг ЭГЭ/100 г соответственно. Кроме того, водный экстракт RC обладал самой высокой антиоксидантной активностью, используя очистку от свободных радикалов в EC.50значения 0,13 мг GAE / мл, тогда как экстракт этанола и ацетона показал EC50при 0,26 и 0,61 мг GAE/мл соответственно. Наконец, водный экстракт также показал самую высокую общую антиоксидантную активность с использованием анализа FRAP на уровне 0,93 ммоль/г, за которым следуют экстракты этанола и ацетона (0,18 и 0,04 ммоль/г). Экстракты впоследствии исследовали на их цитотоксичность. Цитотоксичность сырых экстрактов РЦ исследовали на клеточных линиях L929, BHK(21)C13, HepG2 и Caco-2. Токсичность проявлялась при высоких концентрациях более 100µг/мл для всех экстрактов, что будет индексом для дальнейшего использования рекомендуемой концентрации. Ключевые слова:цитотоксичность, антиоксидантная активность, биохимия, FARP Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com В качестве. J. Food Ag-Ind.2008 г., 1(02) 117

Введение
Тунбергия лавроволистнаяLindl., широко известный на тайском языке как Rang Chuet (RC), принадлежит к ботаническому семейству Acanthaceae. Он использовался в Таиланде как натуральное лекарство на протяжении веков. RC обычно употребляют в виде травяного чая. Используются различные части РЦ, например, водные экстракты свежих листьев, сушеных листьев, высушенных корней и коры в качестве противоядия при отравлениях инсектицидами, этиловым спиртом, мышьяком и стрихнином; высушенный корень также используется как противовоспалительное и жаропонижающее средство (Thongsaard and Marsden., 2002). Кроме того, сообщалось, что листья RC изменяют температуру тела крыс, воздействуя централизованно на центр терморегуляции и/или вызывая вазодилатацию и, таким образом, увеличивая рассеивание тепла (Chamreondararassame, 2003).

Поскольку Rang Chuet использовался в традиционной медицине, исследователи заинтересованы в изучении соединений в экстрактах листьев RC. Канчанапуми другие. (2002) сообщили о двух иридоидных глюкозидах, 8-эпи-грандифориевой и 3'-О-β-глюкопиранозилстиберикозиде, выделенных из надземных частей Тунбергия лавроволистная, наряду с семью известными соединениями глюкозидов. Цветы Тунбергия лавроволистная также сообщалось, что они содержат дельфинидин 3:5-ди-о-β-D-глюкопиранозид, апигенин и апигенин-7-о-β-Dглюкопиранозид (Purnima and Gupta, 1978). Кроме того, сообщалось, что растение содержит флавоноиды, такие как апигенин, казмосиин, дельфинидин-3-5-ди-Ο-β-D-глюкозид и хорогеновую кислоту (Thongsaard and Marsden., 2002).

Сообщалось о фармакологических свойствах неочищенных водных экстрактов Ранг Чует в качестве противоядия при отравлении инсектицидами, лечения наркомании, снижения токсичности инсектицида (Фолидол) и антимикробной активности, а также антиоксидантной активности (Tejasen and Thongthapp, 1979; Rengyutthakan, 1980). ; Тонгсаард и Марсден, 2002; Кхункитти и др., 2003; Шрида и др., 2002). Также сообщалось, что экстракты листьев RC оказывают защитное действие на гепатотоксичность, вызванную этанолом, используя перекисное окисление липидов в печени, концентрацию этанола в крови, а также печеночную алкогольдегидрогеназу (ADH) и альдегиддегидрогеназу (ALDH) в качестве индикаторов (Chanavirat et al., 2000). Также заявлено лечение алкоголизма с помощью его водного экстракта. Спиртовые и гексановые экстракты из Тунбергия лавроволистнаятакже обладает противовоспалительной активностью против индуцированного карагенином отека лапы у мышей (Charumanee et al., 1998).

В этой работе за активностью растительных экстрактов по удалению свободных радикалов следили посредством их реакции со стабильным свободным радикалом DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил) и их ионами трехвалентного железа, снижающими потенциал антиоксидантной активности (FRAP). Кроме того, цитотоксичность неочищенных экстрактов Rang Chuet исследовали на клеточных линиях L929, BHK(21)C13, HepG2 и Caco2. Результаты этого исследования обеспечат лучшее понимание антиоксидантных свойств и цитотоксичности этого растения и, возможно, приведут к выявлению растений с высокой антиоксидантной активностью для дальнейшего изучения и разработки пищевых продуктов с добавленной стоимостью и нутрицевтиков. Кроме того, ИК50ценность экстрактов обеспечит индикаторы безопасного уровня использования в будущем.

Материалы и методы.
Растительные материалы.
Лекарственное растение Ранг Чует,Тунбергия лавроволистная Линдл. (Acanthaceae), используемые в этом эксперименте, были собраны в декабре 2005 г. - феврале 2006 г. в местных районах провинции Накхонратчасима, Таиланд. Листья сушили на воздухе при 60оC в течение 6 ч, после чего измельчали в блендере (National, MX-T2GN, Тайвань) до мелкого порошка и хранили вакуумные пакеты на 4оС до использования. Листовой порошок, такой как этот, является типичным сырьем, используемым для производства экстрактов и/или продуктов травяного чая из RC.

Химикаты и стандарты
Все химические вещества аналитической чистоты, включая: свободный радикал 1,1-дифенил-2- пикригидразил (DPPH), 2,4,6-три(2-пиридил)-s-триазин (TPTZ), железо, хлорид-6-гидрат, Железо, сульфат 7-гидрат, ацетатный буфер pH 4,6, галловая кислота, фенольный реагент ФолинаЧокальтеу и безводный карбонат натрия (Na2СО3) были получены от Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, США). Растворители, включая ацетон, этанол, соляную кислоту и метанол, приобретали у Mallinckrodt-Baker (Филлипсбург, Нью-Джерси, США). Культура клеток, среда, МТТ [3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид], ДМСО, глициновый буфер Соренсена были приобретены в Американской коллекции типовых культур; ATCC (Манассас, Вирджиния, США).

Приготовление экстрактов RC
• Экстракция для теста антиоксидантной активности и общего количества фенолов Порошок листьев массой около 100 мг экстрагировали тремя порциями по 12 мл кипящей воды (100 мл).оC), этанол и ацетон на водяной бане со встряхиванием при 25оС в течение 15 мин. Центрифугирование при 3000 g (Thermo IEC, Waltham, MA) применяли в течение 3 минут между экстракциями три раза. Фильтраты, полученные после вакуумной фильтрации, объединяли и объемы доводили до 50 мл тем же растворителем. Аликвоты по 2 мл переносили в культуральные пробирки (VWR, Уилмингтон, Северная Каролина) и сушили в вакуумной сушилке (Rapid Vap® Vacuum Evaporation Systems, Labconco Corp., Канзас-Сити, Миссури). Образцы хранились при -20оС до использования.

Экстракция растворителем для теста на цитотоксичность
Порошок (5 г) гомогенизировали водой (200 мл), этанолом (200 мл) и петролейным эфиром (200 мл) и гомогенат экстрагировали на шейкере при 555°С.оС в течение 72 часов. затем фильтровали на бумаге Whatman No.1. Фильтрат концентрировали с помощью вакуумного испарителя (BUCHI Rotavapor R-114, Швейцария) и выдерживали при 4оC до использования (Kanchanapoom et al., 2002 с некоторыми изменениями).

Сверхкритическая жидкостная экстракция для теста на цитотоксичность
Порошок просеивали через сито 425 микрон перед экстракцией с использованием сверхкритической жидкостной экстракции. Для экстракции использовали сверхкритический флюидный экстрактор SFE. В этом исследовании экстракция была осуществляют путем заполнения экстракционного сосуда объемом 8 мл 3,0 г просеянного порошка листьев. Затем порошок листьев экстрагировали сверхкритическим CO.2под давлением 250 атм и 50о Температура C в течение 5 минут в статике, затем в течение 15 минут в динамике. В системе SFE для сбора экстрагированных аналитов использовался ограничитель с ручным управлением Duraflow. Сверхкритический CO2 скорость потока через ограничитель Duraflow составляла приблизительно 0,3-0,4 мл/мин (сжатый). Аналиты собирали в 3 мл петролейного эфира (Yamini et al., 2002 с некоторыми изменениями).

Всего фенолов
Общее количество растворимых фенольных компонентов экстрактов (вода, этанол и ацетон) определяли по методу Уотерхауса (2002) с использованием реактива Фолина-Чиокальтеу. с галловой кислотой в качестве стандарта. 20µл свежеприготовленного экстракта РЦ добавляли в кювету на 1,5 мл, к которой добавляли 1,58 м дд воды и 100µl Добавляли реактив ФолинаЧиокальтеу. Образец тщательно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. После инкубации 300µл NaCO3Добавляли раствор (2% масс./об.) и смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Поглощение измеряли при 765 нм. Результаты выражали в эквивалентах галловой кислоты.

Анализ удаления свободных радикалов
DPPH Активность экстрактов RC (ацетон, этанол и вода), BHT и аскорбиновой кислоты по удалению свободных радикалов DPPH определяли с использованием спектрофотометра DU 800 (Beckman Coulter, CA) в соответствии с методом, описанным Ferruzzi.и другие. (2002) с точки зрения способности отдавать водород или поглощать радикалы. Вкратце, готовили 0,1 мМ раствор DPPH в метаноле. Начальное поглощение ДФПГ в метаноле измеряли при 515 нм и не менялось в течение всего периода анализа. Аликвоту (100 мкл) экстракта, разбавленного в диапазоне концентраций 0,01-0,15 мг ГАЭ/мл, смешивали с 1,9 мл метанольного раствора ДФПГ. Изменение поглощения при 515 нм измеряли через 15 мин. Процент поглощения рассчитывали как отношение поглощения образца к контрольному раствору DPPH без экстрактов. BHT и аскорбиновую кислоту в растворе MeOH использовали в качестве положительных контролей. ЕС50экстрактов рассчитывали при 15-минутном значении очистки с использованием нелинейной регрессии Sigma Plot 9.1 (Systat Software Inc, Иллинойс). Ингибирование свободнорадикального DPPH (%) рассчитывали по формуле:

Ингибирование % = (Апустой-Аобразец/Апустой) × 100

Где пустой представляет собой оптическую плотность контрольной реакции (содержащей все реагенты, кроме испытуемого соединения), а Aобразец- абсорбция испытуемого соединения. Точная концентрация, обеспечивающая 50% ингибирование (IC50) рассчитывали по графику зависимости % ингибирования от концентрации экстракта. Испытания проводились в трехкратной повторности. Синтетический антиоксидант BHT и аскорбиновая кислота были включены в эксперименты в качестве положительного контроля (Schlesier et al., 2002).

Анализ железоредуцирующей антиоксидантной способности
(FRAP) Метод Вонга,и другие.(2006) был использован. Вкратце, реагент FRAP готовили из ацетатного буфера (pH 3,6), 10 ммоль раствора TPTZ в 40 ммоль HCl и 20 ммоль раствора хлорида железа в пропорции 10:1:1 (об./об.) соответственно. Реактив FRAP был свежим и ежедневно готовился и нагревался до 37°С.оC на водяной бане перед использованием. Экстракт 50µл добавляли к 1,5 мл реагента FRAP. Затем регистрировали поглощение реакционной смеси при 593 нм через 4 мин. Стандартную кривую строили с использованием раствора сульфата железа (100-2000 мкм), а результаты выражали в мкмоль-эквивалентах железа на г сухого веса растительного сырья. Все измерения были проведены в трех экземплярах и рассчитаны средние значения.

Культура клеток
Клетки-мишени представляли собой L929 (соединительная ткань мыши, ECACC, кат. № 85011425), BHK(21)C13 (детеныши сирийского хомячка, почки ECACC, кат. № 85011433), HepG2 (гепатокарцинома печени человека, ATCC, кат. № HB-8065) и Caco2 (аденокарцинома толстой кишки человека ATCC Кат. № HTB-37, ATCC, США). Клетки L929 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина. Клетки BHK(21)C13 выращивали в модифицированной Глазго среде Игла (GMEM) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1,5 г/л триптозофосфатного бульона и 2 мМ L-глутамина. HepG2 и Caco2 выращивали в минимальной основной среде (MEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 0,1 мМ заменимой аминокислоты MEM, 1,0 мМ пирувата натрия и 2 мМ L-глутамина. Все клетки инкубировали при 37оC в полностью увлажненном инкубаторе с 5% CO2: 95% воздушной атмосферы.

Цитотоксичность
L929, BHK(21)C13, HepG2 и Caco2 высевали в 96-луночный планшет с 500 клетками на лунку для L929 и 2000 клеток на лунку для других и инкубировали в течение 48 часов. Все высушенные неочищенные экстракты RC растворяли в этаноле для получения исходного раствора, затем разбавляли до различных концентраций экстракта в среде от 1,56 мкг/мл до 200 мкг/мл. Экстракты добавляли в лунки и инкубировали в течение 24 часов. Исследуемые образцы удаляли из клеточных культур и клетки реинкубировали еще 24 ч в свежей среде, а затем тестировали с МТТ.

Короче, 50µВ среду в каждую лунку добавляли л МТТ в PBS в концентрации 5 мг/мл и клетки инкубировали в течение 4 часов. Затем из лунок отсасывали среду и МТТ и растворяли формазан в 200 мкл.µл ДМСО и 25µл глицинового буфера Соренсена, рН 10,5. Оптическую плотность считывали с помощью планшетного ридера при длине волны 570 нм. Данные анализировали с помощью программы SoftMax (Molecular Devices) для определения IC50.50 для каждого образца экстракта. Были установлены два контроля, один со средой в качестве контроля реагента и второй с 1% этанолом в качестве контроля растворителя.

Кривая доза-реакция была получена для 8 концентраций в тестовом диапазоне 200-1,56. µг/мл с использованием 4 лунок на концентрацию для определения среднего значения каждой точки. В каждом были получены кривые ответа на 2 дозы эксперимента. Результаты токсичных соединений выражали как концентрацию образца, необходимую для уничтожения 50% (IC50) клеток по сравнению с контролем.

Статистический анализ
Описательная статистика, включая среднее значение и стандартную ошибку среднего (SEM), рассчитывали для антиоксидантной активности каждого экстракта (n=3).

Результаты и обсуждение
Измерение антиоксидантной активности
Генерация радикальных окислительных частиц включает либо радикальные процессы, либо различные потенциальные окислительно-восстановительные системы. Растворимость антиоксидантных соединений определяет их эффективную антиоксидантную активность как в водной, так и в липидной системах (Санчес-Гонсалес,и другие., 2005). Поэтому для оценки антиоксидантного действия были выбраны две модели на водной основе. активность экстрактов RC, один из которых измеряет активность по удалению радикалов, а другой измеряет общую восстановительную способность.

Общее содержание фенолов
Содержание фенолов в водном, этанольном и ацетоновом экстрактах РЦ определяли с использованием реактива Фолина-Чиокальтеу. Выход и общее содержание фенолов в экстрактах RC представлены в таблице 1. Было обнаружено, что содержание фенолов в водном экстракте имеет самое высокое содержание фенолов (2433,9 мг GAE/100 г), за которым следуют этанол (565 мг GAE/100 г) и ацетон (142,1 мг GAE/100 г). мг ГАЭ/100 г). Сравнивая эффективность экстракции кипящей водой, этанолом и ацетоном, метод с использованием кипящей воды показал наибольшую эффективность при экстракции фенольных соединений. Следовательно, можно ожидать, что водный экстракт RC будет иметь самую высокую антиоксидантную активность. Экстракты ацетона дали самый высокий выход экстракта 36,6% (г/г порошка листьев x100), но этот экстракт показал самое низкое содержание фенолов.

Метод экстракции также имеет решающее значение для восстановления антиоксидантных фитохимических веществ. Для достижения хорошей эффективности экстракции следует учитывать природу как растительных материалов, так и биологически активных компонентов. Липофильность или гидрофильность влияет на растворимость фитохимического вещества в экстрагирующем растворителе, и, наоборот, полярность растворителя также влияет на эффективность экстракции. Для антиоксидантных фитохимических веществ существует множество различных методов экстракции, но большинство из них основано на экстракции растворителем с использованием воды, органического растворителя или сжиженного газа или их комбинации при различных температуре и давлении, хотя другие методы, такие как физическое прессование, фильтрация, проточная дистилляция и абсорбция твердых частиц (Tsao and Deng, 2004).

Полярные антиоксиданты, такие как фенольные кислоты и гликозиды многих флавоноидов, обычно экстрагируют водой, спиртом или смесью воды и спиртов. Наши результаты (таблица 1.) согласуются с этими предыдущими представлениями. Для антиоксидантов, таких как агликоны некоторых флавоноидов, используются неводные растворители (Tsao and Deng, 2004). Эффективность кипячения воды при извлечении соединений, проявляющих антиоксидантную активность, выше, чем у метанольного экстракта (Wong et al., 2006).

DPPH представляет собой стабильный азотцентрированный свободный радикал. Цвет меняется с фиолетового на желтый при восстановлении либо в процессе водорода, либо в результате отдачи электронов. вещества, которые способны выполнять это восстановление, могут рассматриваться как антиоксиданты и, следовательно, поглотители радикалов (Hinneburg et al., 2006). Способность соответствующего экстракта отдавать атомы водорода или электроны будет измеряться по отбеливанию окрашенного в фиолетовый цвет метанольного раствора DPPH.

Исследуемые экстракты проявляли очистительную активность различной силы и зависели от дозы во всех экстрактах. Кроме того, положительные контроли с BHT и аскорбиновой кислотой были протестированы на их удаление радикалов DPPH. Расчетное ЕС50в течение 15 минут инкубации приведены в таблице 2.

Активность по удалению радикалов DPPH водными, этанольными и ацетоновыми неочищенными экстрактами RC показала антиоксидантную активность при рассмотрении EC.50ценности. Более низкое значение EC50 указывает на более высокую антиоксидантную активность. Водный экстракт обладает самой высокой очищающей активностью. среди всех экстрактов. Более того, очищающая активность водного экстракта и аскорбиновой кислоты близко сопоставима, и, по-видимому, существует тесная корреляция между очищающей активностью и содержанием фенолов в экстрактах RC.

Разница в антиоксидантной активности среди экстрактов RC обусловлена множеством факторов, включая концентрацию экстрактов и качественный профиль экстрактов. Водный экстракт имел в основном такие компоненты, как апигенин и фенольные кислоты, такие как кофейная кислота и галловая кислота, а также ацетон и этанол, основные компоненты которых были производными хлорофилла и лютеином (данные не представлены).

Антиоксидантная активность
Антиоксидантный потенциал экстрактов RC оценивали по их способности восстанавливать комплекс TPTZ-Fe(III) до комплекса TPTZ-Fe(II) (анализ FRAP), который является простым, быстрым и воспроизводимым (Wong et al., 2006). . FRAP универсален и может быть легко применен как к водным, так и к спиртовым экстрактам различных растений. Результаты выражены в молярных эквивалентах железа на грамм образца.

В таблице 3 показана антиоксидантная активность экстрактов RC, включая положительный контроль BHT. Для экстрактов РЦ антиоксидантная активность колебалась от 0,044 до 0,928 ммоль Fe(II)/г. Водный экстракт показал самую высокую антиоксидантную активность (0,928 ммоль Fe(II)/г), за ним следуют этанольный экстракт (0,079 ммоль Fe(II)/г) и ацетоновый экстракт (0,044 ммоль Fe(II)/г). Вонг и др. (2006) классифицировали категории лекарственных растений на основании их антиоксидантной активности: чрезвычайно высокая (> 500 мкмоль Fe(II)/г), высокая (100–500 мкмоль Fe(II)/г), средняя (10–100 мкмоль Fe(II)/г). II)/г) и низкой (<10 мкмоль Fe(II)/г). Согласно этой классификации, В качестве. J. Food Ag-Ind.2008 г., 1(02) 123 водный экстракт проявлял чрезвычайно высокую антиоксидантную активность, в то время как этанольный и ацетоновый экстракты проявляли среднюю антиоксидантную активность. В этом исследовании RC экстрагировали кипящей водой, аналогично традиционному тайскому методу, используемому для лекарственных трав. Остальные образцы были экстрагированы более современным методом с использованием этанола и ацетона.

Следует добавить, что листья RC доступны по низкой цене и, таким образом, представляют собой экономичный источник потенциальных природных антиоксидантов для использования в качестве пищевых добавок или пищевых добавок. Результаты в сочетании с фитохимическим профилированием показали, что листья RC содержат фенольную кислоту, такую как галловая кислота, кофейная кислота, протокатеховая кислота, кроме того, что они содержат флавоноиды, такие как апигенин и глюкозиды апигенина (данные не представлены). Сообщалось, что кофейная кислота обладает антиоксидантной активностью (Son and Lewis, 2002), и эта фенольная кислота был обнаружен во всех экстрактах, причем самый высокий уровень был обнаружен в водном экстракте (142,1 мг / 100 г), что, таким образом, связано с самой высокой антиоксидантной активностью как по нейтрализации радикалов, так и по анализу FRAP. Интересно, что галловая кислота является компонентом водного экстракта, обладающим самой высокой антиоксидантной активностью. Вонг,и другие. (2006) сообщили, что галловая кислота, выделенная из китайских лекарственных растений, показала сильную активность по удалению радикалов DPPH. Однако по сравнению со стандартами в анализе FRAP, BHT (1,421 ммоль Fe(II)/г), аскорбиновой кислоты (119,5 ммоль Fe(II)/г) и тролокса (7,2 ммоль Fe(II)/г), все экстракты RC показал относительно скромную общую антиоксидантную активность.

Антиоксидантная активность может быть объяснена восстановителями, а инактивация оксидантов восстановителями может быть описана как окислительно-восстановительные реакции, в которых одна реакционная частица (оксидант) восстанавливается за счет окисления другого антиоксиданта. Анализ FRAP измеряет антиоксидантный эффект любого вещества в реакционной среде как восстанавливающую способность. В этом анализе антиоксидантную активность определяют на основе способности восстанавливать двухвалентное железо до двухвалентного. В анализе DPPH антиоксиданты восстанавливают свободный радикал 2,2-дифенил-1- пикрилгидразил, который имеет максимум поглощения при 515 нм (Wong,и другие, 2006).

Водный экстракт показал самую высокую антиоксидантную активность как по результатам анализа DPPH, так и по анализу FRAP. Это можно объяснить тем, что водный экстракт обладает способностью восстанавливать как радикалы, так и ионы трехвалентного железа, а также лучше восстанавливать радикалы. Кроме того, все экстракты проявляли антиоксидантную активность по-разному, в зависимости от компонентов в каждом экстракте. То, что водный экстракт показал самую высокую антиоксидантную активность, может быть связано с тем, что основными составляющими являются фенольные кислоты, флавоноиды и флавоноиды глюкозиды. Предыдущие исследователи сообщали, что флавоноиды и фенольные кислоты являются источником антиоксидантной активности в растениях (Cook and Samman, 1996). Экстракт этанола и ацетоновый экстракт, которые проявляли меньшую антиоксидантную активность, состояли из хлорофиллов, производных хлорофилла и лютеинов. Это может быть объяснено низкой антиоксидантной активностью хлорофиллов и производных хлорофилла. Кроме того, лютеины, идентифицированные в этаноле и ацетоновом экстракте, были в очень небольшом количестве, поэтому не проявляли антиоксидантной активности.

В пищевых продуктах были идентифицированы сотни различных полифенолов. Двумя основными типами полифенолов являются флавоноиды и фенолы. В качестве антиоксидантов полифенолы могут защищать составляющие клетки от окислительного повреждения и, следовательно, ограничивать риск различных дегенеративных заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Фенольные группы в полифенолах могут принимать электрон с образованием относительно стабильных феноксильных радикалов, тем самым нарушая цепные реакции окисления в клеточных компонентах (Scalbert,и другие., 2005).

Флавоноиды являются мощными антиоксидантами, поглотителями свободных радикалов и хелаторами металлов и ингибируют перекисное окисление липидов. Структурные требования к антиоксидантным функциям флавоноидов и защите от свободных радикалов включают наличие гидроксильного углерода в третьем положении, двойных связей между вторым и третьим положением, карбонильной группы в четвертом углеродном положении и полигидроксилирование ароматических колец А и В (Cook and Samman, 1996). ). Активность флавоноидов по удалению радикалов строго контролировалась количеством и конфигурацией фенольных гидроксильных групп в молекулах, а также гликозилированием и конфигурацией других заместителей. Флавоноиды без каких-либо гидроксильная группа (например, транс-халкон, флавон, флаванон и изофлавон) не обладала способностью удалять радикалы (Cai,и другие., 2006).

Результаты анализов антиоксидантов показывают, что все экстракты могут в определенной степени действовать как поглотители радикалов. Водный экстракт показал самую высокую активность в тесте восстановления железа и анализе DPPH. Тем не менее, ЕС50значения для этих экстрактов были все еще ниже, чем для тестируемого эталонного антиоксиданта, аскорбиновой кислоты и БГТ. На основании этих результатов можно предположить, что экстракты RC могут быть естественным источником антиоксидантов в пищевых продуктах, но количество, необходимое для обеспечения антиоксидантной активности, аналогичной антиоксидантам стандартного использования, может быть большим.

Цитотоксичность
За последние несколько десятилетий было разработано несколько анализов in vitro с использованием культур клеток млекопитающих, что позволило избежать чрезмерного использования лабораторных животных, что дорого, требует много времени и часто связано с этическими проблемами. Системы клеточных культур могут быть более чувствительными и более воспроизводимыми, чем тесты на интактных животных (Cetin and Bullerman, 2005).

Цитотоксичность экстрактов RC оценивали в клеточных линиях BHK, L929, Hep G2 и Caco-2 с помощью анализа МТТ (Mossman, 1983). ИС50значение дляТунбергия лавроволистнаяпоказано в Таблице 4. Кроме того, не было различий между двумя контролями среды и 1% этанола, при этом не было токсичности для тестируемых клеточных линий.

Результаты показали, что ИК50в каждой клеточной линии они были затронуты по-разному. Экстракт петролейного эфира показал наибольшую цитотоксичность по отношению к клеточной линии BHK(21)C13 при концентрации 103+ 1µг/мл. Водный экстракт показал наименьшую цитотоксичность по отношению к клеточным линиям BHK(21)C13 и HepG2 при концентрации более 200 мкл.µг/мл. А еще нефть эфирные и этанольные экстракты показали низкую цитотоксичность по отношению к L929 при концентрации более 200 µг/мл. Тем не менее, токсичность для всех экстрактов была указана при высокой концентрации 200 мкг/мл, которая будет показателем для дальнейшего применения рекомендованной концентрации.

Все экстракты RC показали чрезвычайно высокое значение IC50.50(>100 мкг/мл) против всех протестированных клеточных линий, что указывает на низкую цитотоксичность для клеток (Okonogi et al., 2006). При сравнении протестированных клеточных линий было обнаружено, что клетки BHK(21)C13 чувствительны к цитотоксическому действию экстрактов RC, включая петролейный эфир, этанол и экстракты SFE, за которыми следуют Caco-2 и HepG2 после 24-часового воздействия, тогда как клетки L929 показали низкую реакцию на токсичность экстрактов RC. Самая высокая цитотоксичность клеток BHK(21)C13, почки детеныша сирийского хомячка, по отношению к экстрактам RC (петролейный эфир, этанол и SFE) может привести к пониманию того, что эти экстракты RC воздействуют на клетки почек при применении концентрации при определенных значениях. В экстракте петролейного эфира цитотоксичность может быть вызвана самим растворителем и компонентами экстрактов, полученными в результате неполярной экстракции.

Водные экстракты показали низкую цитотоксичность (> 200 мкг/мл) по отношению к клеточным линиям BHK(21)C13 и HepG2, что привело к предложению использовать этот вид экстракта RC из-за его низкой токсичности для клеток почек и линий клеток печени человека. Водная экстракция является нетоксичным методом экстракции, а также экстрагируемыми компонентами могут быть части полифенолов, включая флавоноиды и фенольные кислоты, которые обычно экстрагируются с использованием воды (Tsao and Deng, 2004). Наоборот, водный экстракт показал высокую цитотоксичность при IC50.50147 мкг/мл в отношении клеток Caco-2, что позволяет предположить, что водный экстракт, хотя и проявляет низкую токсичность в отношении клеток почек и печени, умеренно токсичен в отношении клеток кишечника. Для клеток Caco-2 цитотоксичность экстрактов RC при IC5050117, 120 и 147 для СФЭ, водной и петролейно-эфирной вытяжек соответственно. Экстракты SFE проявляют высокую цитотоксичность по отношению к клеткам кишечника человека, и это предполагает осторожное использование с определенная концентрация этого экстракта. При сравнении между протестированными клеточными линиями клетки L929 показали самую низкую цитотоксичность из всех экстрактов RC, что может быть связано с типом клеточных линий (соединительная ткань), и если сравнивать между типами экстрактов RC, водный экстракт имел самую низкую цитотоксичность для все проверенные клеточные линии. оконоги,и другие. (2006) изучали антиоксидантную способность и цитотоксичность кожуры некоторых фруктов в клетках Caco-2 и мононуклеарных клетках периферической крови и сообщили, что кожуру рамбутана можно считать потенциально полезной в качестве источника природных антиоксидантов для пищевых продуктов или лекарственных препаратов из-за их высокой антиоксидантной способности. активность и нетоксичность по отношению к нормальным клеткам (IC50> 100 мкг/мл).

Вывод
Оценивали антиоксидантную активность и общее фенольное содержание экстрактов РЦ. Экстракты RC в целом показали высокую антиоксидантную активность и содержание фенолов, особенно в водном экстракте, за которым следовали этанольный и ацетоновый экстракты соответственно. Относительно, антиоксидантная активность по анализам DPPH и FRAP была самой высокой в воде. экстракта при 0,129 мг GAE/мл и 0,928 ммоль Fe(II)/г соответственно.

Кроме того, значения антиоксидантной активности водного экстракта были меньше, чем в положительном контроле (BHT), в 1 раз по анализу DPPH и в 1,6 раза по анализу FRAP. Более того, существует связь между антиоксидантной активностью и общим содержанием фенолов во всех экстрактах. Высокое общее содержание фенолов показало высокую антиоксидантную активность во всех экстрактах. Можно сделать вывод, что полифенольные соединения вносят вклад в антиоксидантную активность экстрактов РЦ. Кроме того, сырые экстракты RC показали токсичность по отношению к L929, BHK (21)C13, HepG2 и Caco2 в тестируемых диапазонах концентраций от 200 до 1,56 мкг/мл. ИС50можно резюмировать как низкую цитотоксичность при концентрациях более 100 мкг/мл для всех неочищенных экстрактов.

Подтверждение
Эта исследовательская работа была поддержана Проектом развития персонала, Комиссия по высшему образованию, Таиланд в рамках программы консорциума с Департаментом пищевых наук Университета Пердью, США.

Использованная литература
1. Cai, YZ, Sunb, M., Xingc, J., Luod, O., и Corkea, H. (2006). Структура зависимости активности удаления радикалов фенольных соединений из традиционных китайских лекарственных растений.Науки о жизни. 78 (25): 2872 – 2888. 2. Четин, Ю. и Буллерман, Л.Б. (2005). Цитотоксичность микотоксинов Fusarium в культурах клеток млекопитающих, определенная с помощью биоанализа МТТ.Пищевая и химическая токсикология. 43(5): 755 – 764. 3. Чамреондарарассаме, Б. (2003). Влияние листьев Рангджерта на температуру тела. Фармацевтический факультет Чиангмайского университета, Чиангмай, Таиланд. 4. Чанавират, А., Тошулкао, К., Темчароэн, П., Глинсукон, Т. (2000). Защитный эффект Тунбергия лавроволистнаяэкстракт о этанол-индуцированной гепатотоксичности в В качестве. J. Food Ag-Ind.2008 г., 1(02) 127 мышей. Диссертация, Факультет последипломного образования, Университет Махидол, Бангкок, Таиланд. 5. Чарумани С., Веджабхикул С., Таесотикул Т., Нетсингха В., Сирисаад П., Лилапорнписит П. (1998). Разработка местных противовоспалительных препаратов. Из исследовательского отчета фазы I. Фармацевтический факультет Чиангмайского университета, Чиангмай, Таиланд. 6. Кук, Северная Каролина, и Самман, С. (1996). Флавоноиды-химия, обмен веществ, кардиопротекторное действие и пищевые источники.Биохимия питания. 7: 66 – 76. 7. Ферруцци М.Г., Бом В., Кортни П.Д. и Шварц С.Дж. (2002). Антиоксидантная и антимутагенная активность пищевых производных хлорофилла, определенная с помощью анализа удаления радикалов и обратного бактериального мутагенеза.Дж. Пищевая наука.67(7):2589-2595. 8. Хиннебург, И., Дэмиен Дорман, Х.Дж., и Хилтунен, Р. (2006). Антиоксидантная активность экстрактов избранных кулинарных трав и специй.Пищевая химия. 97: 122-129. 9. Канчанапум Т., Касаи Р. и Ямасаки К. (2002). Иридоидные глюкозиды из Тунбергия лавроволистная.Фитохимия60: 769-771. 10. Кхункитти В., Тавичайсупапонг С., Аромди А. и Песе М. (2003). Антимикробная активностьТунбергия лавроволистнаясырой экстракт.3рдВсемирный конгресс по лекарственным и ароматическим растениям на благо человека, 3-7 февраля 2003 г., Чиангмай, Таиланд. 11. Мосманн, Т. (1983). Быстрый колориметрический анализ клеточного роста и выживания: применение для анализа пролиферации и цитотоксичности.Дж. Иммунол. Методы. 65 (1-2): 55-63. 12. Оконогия С., Дуанграта С., Анучпреэдаб С., Тачакиттирунгрода С. и Чоуванапунпона С. (2006). Сравнение антиоксидантной способности и цитотоксичности кожуры некоторых фруктов.Пищевая химия. Статья в прессе. 13. Пурнима и Гупта, ПК (1978). Окраска имеет значение из цветков Тунбергия лавроволистная.J. Индийская хим. соц.ЛВ, июнь. 14. Рюнгюттхакан В. (1980). Фармакологические исследования листьев Rang Chuet. Магистр Тезис. Чиангмайский университет. Таиланд. 15. Санчес-Гонсалес И., Хименес-Эскриг А. и Саура-Каликсто Ф. (2005). Антиоксидантная активность in vitro кофе, приготовленного с использованием различных способов (итальянский, эспрессо и фильтр).Пищевая химия, 90: 133 – 139. 16. Скальберт А., Манах К., Моран К. и Ремеси К. (2005). Пищевые полифенолы и профилактика заболеваний.Критические обзоры продуктов питания и питания. 45: 287–306. В качестве. J. Food Ag-Ind.2008 г., 1(02) 128 17. Шлезьер К., Харват М., Бом В. и Битч Р. (2002). Оценка антиоксидантной активности различными методами in vitro.Свободнорадикальные исследования. 36 (2): 177–187. 18. Шрида, К., Ханкете, Дж., Ханкитти, В., Аромди, К., и Пезе, М. (2002). Антиоксидантная активностьТунбергия лавроволистнаяспиртовой экстракт.Тайский Дж. Фарм. науч. Том. 26. 19. Цао Р. и Дэн З. (2004). Процедуры разделения природных антиоксидантных фитохимических веществ.Дж. Хроматог. Б. 812: 85 – 99. 20. Теджасен, П. и Тонгтапп, К. (1979). Изучение антитоксичности инсектицидов Тунбергия лавроволистнаяЛинн.Чиангмай. Бык. 19, стр. 105-114. 21. Тонгсаард, В. и Марсден, Калифорния (2002). Фитотерапия, используемая при лечении зависимости, имитирует действие амфетамина на высвобождение дофамина в эксперименте на крысах in vitro.Неврологические письма. 329(2): 129-132. 22. Вонг, К.С., Ли, Х., Ченг, К., и Чен, Ф. (2006). Системное исследование антиоксидантной активности 30 китайских лекарственных растений с использованием анализа антиоксидантной способности восстановления железа.Пищевая химия. 97: 705 – 711. 23. Ямини Ю., Асгари-Хиави М. и Бахрамифар М. (2002). Влияние различных параметров на сверхкритическую флюидную экстракцию стероидных препаратов из матриц с шипами и таблеток.Таланта, 58 (5): 1003-1010

Фитомедицина 1999, 6(4) № 217−23.